• English (United States)
  • 日本語

転写

転写

1サンプル分の転写反応液組成を以下のテーブルに示します。転写溶液は、1.5mℓチューブ中で氷上調整を行います。

2nd PCR productは 10 x Transcription Bufferと直接混合しないように注意してください。
なお、2nd PCR productは精製は不要です。

組成

Reagents
10 X Transcription Buffer 2.5 μℓ
25 mM NTPs 2.5 μℓ
0.1 M DTT 1.25 μℓ
T7 RNA Polymerase 1 μℓ
2nd PCR product 2.5 μℓ
RNase-free water(DEPC) 15.25 μℓ
Total 25 μℓ

 

転写反応と転写産物(mRNA)の精製
  1. チューブの蓋にパラフィルムを巻き、タッピングで軽く混ぜ、卓上遠心機で壁面についた溶液を落とし、37°Cのウォーターバスまたはインキュベーターで約3時間反応させます。
  2. 転写反応終了後、アガロースゲル電気泳動を用いて1 µlの転写産物を確認します。(下図参照)
  3. 1サンプル(25 µl)に対して10 µlの4 M 酢酸アンモニウムを加えてよく混ぜ、100 µlの100% エタノールを加え転倒混和し、卓上遠心機で数秒間遠心分離した後、氷上で20分間静置します。
  4. 遠心分離(15,000 rpm、20分、4°C)します。
  5. 上清をピペットマンで除去後、卓上遠心機を用い数秒間遠心する。再度上清をピペットで除去する。この時、チップの先端が沈殿に触れないように注意します。
  6. 沈殿が半乾燥状態になるまで静置します。マイクロチューブの蓋をあけておくため、埃、つばに注意してください。(核酸乾燥機は不可)
  7. 1サンプル(25 µlの転写反応液)に対して70 µlのRNase free水(DEPC水)を加え、チップで沈殿をよく懸濁し、これをmRNA溶液とします。
    マイクロチューブ壁面にmRNAが確認しにくい状態で付着している場合があるので、注意してください。

 

mRNAの検出
  1. RNAサイズに応じた濃度のアガロースゲルを作成し、電気泳動槽にセットします。
  2. mRNAを未精製の状態で、上記1のゲルに1μℓのサンプルをロードします。
  3. 電気泳動完了後のゲルをEthidium Bromideで30分染色します。
  4. トランスイルミネータにより、mRNAの蛍光検出を行います。