技術

技術概要

製品のコア技術は3つあります。

鋳型作成系:

鋳型作成系では、mRNAを安定して合成するために従来3’UTR側の配列が1200bp程度必要とされていましたが、ポリAを含む50bp程度の配列で従来同様機能することが発見されました。この配列をORFの3’UTR側に付与することで、C末端へのタグ付けもPCRで可能となりクローニングが不要となりました。

トランケーションによるサブクローニングも不要で、様々なドメインのタンパク質を非常に簡便に、汎用的かつ網羅的に作成できるようになりました。

1st primer design tool

プライマーの設計は、ダウンロードページの1stプライマー設計支援ツールをご利用頂ければ、最近接塩基対法とGC%法のそれぞれで、Tm値の差が最も小さい最適なプライマー配列を得ることも簡単です。
(ダウンロード:1stprimeraidv2.zip )

PCR酵素は、1 kb あたり伸長時間 30 secを実現し、更に、Taqポリメラーゼの80倍の正確性を有しています。また、20 mer 以上のプライマー(Tm値 > 63°C)では、面倒なサイクル条件が不要になります。
更に、従来の3ステップPCRサイクルに比べ、1/3程度の時間で遺伝子増幅・転写・翻訳でトラブルになる非特異増幅・スメアが少なく、下記電気泳動像のように、正確かつ高速に完了します。

(*PCR酵素はオールインワンキットBCF4050に同梱になります)

pcr prducts

His, HA, FLAG等のペプチドタグに加え、GST, Halo等の大分子量タグの鋳型もPCRで構築可能です。(プロトコル近日公開予定)

翻訳系:
動画を再生

コムギ胚芽由来の翻訳液の最適化により、従来困難であった、膜タンパク質も合成が可能になり、可溶化タンパク質のほぼ全てと、膜タンパク質の合成が可能となりました。特に膜タンパク質の発現には、人工リポソームの添加は不要です。膜タンパク質の細胞膜貫通部分にはコムギ胚芽由来の脂質(膜断片)が吸着しており、可溶化発現します。

簡便な発現方法:

Simple Mixture

翻訳反応に調製するアミノ酸は析出の懸念がありましたが、特殊な技術により20種のアミノ酸が高濃度の1液になっています。従って、翻訳反応液の調製は、提供のコムギ胚芽抽出液とアミノ酸ミックスを混合するだけです。また、翻訳反応は、そこに転写反応で得たmRNAを投入しインキュベートするだけの簡便な混合法がご利用頂けます。サポートページに調製工程を含めた手技動画を掲載していますので、ご参考ください。

これら3つの全く新しい技術により、従来は合成が困難であった次のようなタンパク質が極めて簡便に合成できるようになっています。

発現例

10 kDa から 200 kDa まで

10 kDa から 200 kDa程度までの分子量のタンパク質が発現します。

左図では、光に応答して活性が変化する受容体タンパク質や、疾病応答に重要な転写因子等も活性をもって合成できています。

大分子量タグ・ダブルタグ
GST tag and FLAG tag

His, HA, StrepII, FLAG等のペプチドタグに加え、大分子量のGST, Haloタグ等もPCRで付与可能です。

左図は、サイトカイン(CSF3)のORFにN末端側にFLAGとGSTの2つのタグを付与し翻訳させた結果のFLAG抗体を用いたウェスタンブロット像です。

分子量はそれぞれ CSF3 22.3 KDa, GST 25.6 KDa (UniProtによる)です。

なお、CSF3にFLAGタグのみの場合は下記”分泌タンパク質”の項を参照ください。

 

リン酸化酵素

これまで合成が困難であったヒトや植物の免疫反応に関与するリン酸化酵素も活性をもって合成できています。

細胞毒性のあるタンパク質

細胞を用いた組換え発現では難しかった、細胞毒性のあるリボソーム不活性化タンパク質(rRNA N-glycosidase, トリチン)も合成できます。

分泌タンパク質

分泌タンパク質・サイトカイン(granulocyte-colony stimulating factor, GCSF, CSF3)も合成できます。

細胞膜貫通型受容体キナーゼ

細胞膜貫通型受容体キナーゼも可溶化して合成できています。

多剤排出輸送体

生物界に普遍的に存在し、薬剤を放出する重要なトランスポーターが、可溶化して合成できています。