1.2 2nd PCR

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1.2 2nd PCR

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2nd PCRの反応液組成およびプログラムです。

組成は、N末端タグ用とC末端タグ用で異なりますのでご注意ください。また、プライマーは濃度が異なるものがありますのでご注意ください。（赤字）

PCRプログラムはN末端タグ用とC末端タグ用で共通です。

なお、当社BCF4050同梱のPCR酵素でのプログラム例を示しています。PSS4050をお使いの場合は、2ステップPCRサイクルが可能なPCR酵素(例：KOD-Plus-NEO等)の用法に従ってください。

 

N末端タグ用 2nd PCR Solution

     Reagents
 10x PCR buffer 5 μℓ
 2 mM dNTPs 5 μℓ
 25 mM MgSO4 3 μℓ
 10 μM 2nd_NF2 1 μℓ
 100 nM 2nd_NF1 1 μℓ
 100 nM 2nd_NR1 1 μℓ
 10 μM 2nd_NCR2 1 μℓ
 1st PCR product 1 μℓ
 PCR NDA Polymerase 1 μℓ
 Ultra pure water 31 μℓ
     Total 50 μℓ

C末端タグ用 2nd PCR Solution

     Reagents
 10x PCR buffer 5 μℓ
 2 mM dNTPs 5 μℓ
 25 mM MgSO4 3 μℓ
 10 μM 2nd_CF1 1 μℓ
 100 nM 2nd_CR1 1 μℓ
 10 μM 2nd_NCR2 1 μℓ
 1st PCR product 1 μℓ
 PCR NDA Polymerase 1 μℓ
 Ultra pure water 32 μℓ
     Total 50 μℓ

 

2nd PCR Program(C末端タグ、N末端タグ共通）

Seg.  Temp. Time Cycle
1  94 °C 2 min 1
2-1  98 °C 10 sec  
2-2  60 °C 1min 5
2-3  68 °C 30 sec/kb *  
3-1  98 °C 10 sec 30  
3-2  68 °C 30 sec/kb *
4  72 °C 2 min 1
5  20 °C  – –

* 1kb以下のものは、1minにしてください